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【脑肿瘤前沿】RNA m6A读码蛋白酶YTHDF2是胶质瘤干细胞的潜在靶点

2021-09-27 刘玉娥 施裕丰

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胶质母细胞瘤(世界卫生组织定义的IV级胶质瘤)是最常见的原发性脑瘤,目前尚无有效治疗方法,患者的中位生存期仅为一年多[1,2]。胶质母细胞瘤内存在具有自我更新能力的胶质母细胞瘤干细胞(GSC),GSC在抵抗治疗、血管新生以及免疫逃逸中有重要作用,是胶质母细胞瘤难以治愈和复发的根源[3-5]


目前精准医学在神经肿瘤的大多数患者中疗效甚微,而表观遗传相关的细胞状态研究正成为一个重要的突破方向[6]。RNA转录后的表观转录组学增加了人们对正常细胞和肿瘤细胞不同调控层次的理解。RNA甲基化修饰占所有修饰的60%以上,N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA和lncRNA上最为普遍的修饰[7],可以调节mRNA的稳定性与翻译[8,9]m6A修饰主要发生在PRACH序列的腺嘌呤上,其功能由编码蛋白酶(writer)、消码蛋白酶(eraser)和读码蛋白酶(reader)决定。编码蛋白酶即甲基转移酶,如METTL3、METTL14、WTAP等;而去除m6A修饰的消码蛋白酶即去甲基化酶ALKBH5和FTO,可以逆转甲基化;m6A由m6A结合蛋白识别,目前已知的m6A结合蛋白即读码蛋白包括YTHF1,YTHDF2,YTHDF3等[10]m6A编码蛋白和消除蛋白在癌症中受到不同程度的调节,但RNA的m6A甲基化和肿瘤发生发展的关系尚不清楚。最新研究表明,m6A修饰可以促进肿瘤生长与存活[11]。M6A的编码蛋白包含一个YTH的结构域,介导其与RNA的结合。目前已知有5种蛋白含有YTH的结构域,其中包括YTHDC1 (在细胞核内调控转录后的剪接)、YTHDC2和YTHDC3, 后两者主要在细胞质里。这三种YTHDF蛋白共同作用介导了带有m6A修饰的mRNA的降解。










2021年2月,美国加州大学圣地亚哥分校Jeremy N Rich 课题组、南京医科大学汪秀星课题组、美国桑福德-伯纳姆-普利贝斯医学发现研究所Jing Crystal Zhao课题组合作在《Cancer Discovery》期刊发表专业论文,通过对比正常神经细胞和胶质母细胞瘤干细胞的转录组学m6A测序,探索m6A读码蛋白在胶质母细胞干细胞中的功能,寻找这些表观转录组学背后的机制,发现YTHDF2依赖于m6A发挥作用,是一类重要的稳定的致癌基因。






通过对病人来源的GSC细胞和正常神经干细胞(NSC)进行转录组的m6A甲基化测序,发现GSC中有m6A修饰峰的基因的表达被上调,而没有m6A峰的基因表达下调。在GSC中,促癌基因的m6A修饰出现特异性的升高并维持其mRNA处于高水平。根据TCGA数据库显示,m6A信号最强的前100个基因在GSC中的表达远高于NSC,表明GSC的m6A修饰促进胶质瘤中重要促癌基因的表达。在GSC中,m6A修饰比较多的基因一般和细胞通讯、信号传导、转录调控等相关。以上分析表明:在GSC中,特异性的m6A修饰维持促癌基因的稳定性。


作者进一步展开了对m6A修饰读码蛋白、编码蛋白和消码蛋白的研究,TCGA人类胶质瘤数据库显示,编码蛋白和消码蛋白与肿瘤级别无关,而读码蛋白YTHDF2和YTHDF3在高级别肿瘤中表达上调。YTHDF2在胶质瘤的间充质干细胞中表达丰度较高,敲除YTHDF2可以大幅度降低胶质瘤干细胞活力,降低其自我更新能力,减少细胞球形成,降低干细胞标记分子SOX2和OLIG2的表达,YTHDF2补救实验充分证明了YTHDF2对维持GSC的干性十分重要。


为了探究YTHDF2在GSC中的功能,作者对YTHDF2的下游基因做了RNA测序,敲除YTHDF2导致一系列基因表达发生变化。在GSC和NSC中,敲低YTHDF2后,m6A修饰变化不同。GSC中有m6A修饰的基因表达随着YTHDF2的降低而下调,说明YTHDF2对GSC转录的调控依赖于m6A修饰。通过交联免疫共沉淀以及生信分析,作者找出了YTHDF2敲低后直接影响的30个基因,其中包括重要的癌基因MYC和VEGFA。在病人来源的GSC中, YTHDF2 和MYC的mRNA有选择性结合,但是在HNP1 和NSC中则没有这种结合发生。进一步研究发现,YTHDF2可以特异性地稳定GSC中MYC和VEGFA的转录。


MYC是肿瘤干细胞的重要调控基因,YTHDF2和MYC的关系表明YTHDF2有可能通过MYC调控GSC的干性和细胞活力。敲低MYC也可以降低VEGFA和IGFBP3等YTHDF2下游基因的表达。过表达MYC可以补救YTHDF2敲低诱导的细胞死亡,也可以使YTHDF2敲低导致的VEGFA和IGFBP3等靶基因mRNA水平恢复。NSC中敲低YTHDF2不影响MYC的表达,而在GSC中,MYC的表达随着YTHDF2的敲低而降低。这些研究表明:在GSC中,MYC是YTHDF2的一个关键下游感受器。YTHDF2可以特异性地维持MYC mRNA地稳定性进而维持MYC在GSC中的功能。敲除YTHDF2后,下调基因中最显著的是IGFBP3, YTHDF2结合IGFBP3 但是不影响其mRNA水平的稳定性。不管敲低YTHDF2还是敲低MYC, IGFBP3的表达都下调,IGFBP3可以补救由于YTHDF2敲低导致降低的肿瘤增殖能力。进一步研究发现IGFBP3是GSC中YTHDF2-MYC轴的下游靶点。接着,作者对上述机制进行了体内验证,发现敲除YTHDF2抑制了GSC细胞的体内成瘤能力,YTHDF2的表达与不良预后密切相关,在YTHDF2敲除的GSC中过表达IGFBP3可以恢复其体内成瘤能力。这表明,YTHDF2-MYC轴通过下游效应分子IGFBP3促进小鼠体内肿瘤生长。


综上所述,作者通过一系列的实验以及测序和生信分析,对胶质母细胞瘤的m6A修饰进行了详细的研究,发现与正常的神经干细胞相比,在GSC中,YTHDF2特异性的通过对促癌基因mRNA修饰来促进他们的表达并在GSCs干性维持中发挥关键作用,进一步研究发现,这种作用通过YTHDF2-MYC-IGFBP3信号轴来实现。该研究揭示了m6A结合蛋白YTHDF2的一条新的信号转导途径,首次阐明了YTHDF2特异性结合并稳定了GSCs中MYC 基因的mRNA,为治疗胶质母细胞瘤提供了一种新的治疗靶标。


参考文献

[1] Ceccarelli, M., et al., Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell, 2016. 164(3): p. 550-63.

[2] Chen, J., R.M. McKay, and L.F. Parada, Malignant glioma: lessons from genomics, mouse models, and stem cells. Cell, 2012. 149(1): p. 36-47.

[3] Bao, S., et al., Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature, 2006. 444(7120): p. 756-60.

[4] Singh, S.K., et al., Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res, 2003. 63(18): p. 5821-8.

[5] Gimple, R.C., et al., Glioblastoma stem cells: lessons from the tumor hierarchy in a lethal cancer. Genes Dev, 2019. 33(11-12): p. 591-609.

[6] Mack, S.C., et al., Chromatin landscapes reveal developmentally encoded transcriptional states that define human glioblastoma. J Exp Med, 2019. 216(5): p. 1071-1090.

[7] Dominissini, D., et al., Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature, 2012. 485(7397): p. 201-6.

[8] Frye, M., et al., RNA modifications modulate gene expression during development. Science, 2018. 361(6409): p. 1346-1349.

[9] Meyer, K.D., et al., 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell, 2015. 163(4): p. 999-1010.

[10] Meyer, K.D. and S.R. Jaffrey, Rethinking m(6)A Readers, Writers, and Erasers. Annu Rev Cell Dev Biol, 2017. 33: p. 319-342.

[11] Bai, Y., et al., YTHDF1 Regulates Tumorigenicity and Cancer Stem Cell-Like Activity in Human Colorectal Carcinoma. Front Oncol, 2019. 9: p. 332.


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