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2020脊髓损伤基础与临床研究6大进展

2021-01-26 卢春李 马龙冰

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尽管2020年在脊髓损伤基础研究方面取得了可喜的进展,如内源性、外源性干细胞的修复作用及机制,小胶质细胞在瘢痕形成中的作用及对轴突再生的影响,细胞能量对脊髓损伤修复的影响等。
以下内容转载自“宣武神经脊柱资讯”公众号


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尽管2020年在脊髓损伤基础研究方面取得了可喜的进展,如内源性、外源性干细胞的修复作用及机制,小胶质细胞在瘢痕形成中的作用及对轴突再生的影响,细胞能量对脊髓损伤修复的影响等。但是在临床应用转化方面,仍然缺少高质量的研究,临床疗效与基础研究也存在着巨大差距。在临床研究方面,争论多年的脊髓损伤后手术时机问题,有了高质量的研究报告。




常驻神经干细胞修复脊髓损伤的可能性


组织的自我再生能力取决于其常驻干细胞的分化潜能,从而取代因损伤而失活的细胞。而中枢神经系统的损伤往往导致永久性的功能损伤。损伤之后被激活的神经干细胞主要分化形成星形胶质细胞,进而以瘢痕取代正常神经组织。2012年,Miller等[1]主张动员内源性干细胞修复和再生来解决这一难题。因此,如何调动常驻神经干细胞进行再生修复,了解神经干细胞是否存在更大的再生潜力以及如何激发这种潜力变得至关重要。


来自瑞典卡罗林斯卡学院神经科学研究所的Enric Llorens-Bobadilla等诸位学者整合了单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究小鼠脊髓成熟神经上皮细胞的谱系潜能。发现在室管膜细胞中生成少突胶质细胞在遗传上是可行的。然而,这个过程是潜在的,因为少突胶质细胞基因本身不表达。在损伤发生后,OLIG2的表达增加了潜在修复的可及性,并随后表达了具有少突胶质细胞特性的基因。损伤后,从室管膜细胞(非星形胶质细胞)中产生有效的少突胶质细胞。利用室管膜衍生细胞的scRNA-seq,发现新的少突胶质细胞完全遵循成熟少突胶质细胞的细胞发育。这些新招募的室管膜来源的少突胶质细胞迁移到脱髓鞘的部位,重新形成髓鞘轴突。最后,利用光遗传学检测到室管膜来源的少突胶质细胞有助于损伤后轴突传导的正常化。该团队将其研究成果于2020年10月发表在Science杂志。


这一发现刷新了人们对于中枢神经系统损伤后再生与修复的认识,在发生中枢神经系统损伤后,成年神经干细胞有更大的再生潜力。这种潜能的靶向激活导致神经干细胞的招募,以产生具有髓鞘再生能力的少突胶质细胞。因此,常驻干细胞可以作为细胞替代的储备者。这提示中枢神经系统损伤后,招募常驻神经干细胞可以作为细胞移植的替代方法。


新生小鼠小胶质细胞可组织脊髓的无瘢痕修复



脊髓损伤会导致大脑与损伤部位以下脊髓轴突连接的破坏。Mokalled与Zukor等[2, 3]对鱼类和两栖动物的研究中曾提出,脑(脊)膜细胞和神经胶质细胞可形成支持损伤部位轴突再生的桥梁。然而,在成年哺乳动物中情况却并非如此,相反,脊髓损伤会触发瘢痕组织的取代,瘢痕由几种类型的细胞组成,例如反应性星形胶质细胞、成纤维细胞、小胶质细胞和巨噬细胞,这些细胞均没有自发组织轴突再生的能力。虽然这些不同类型的细胞及其相关分子都已有相关研究报道,但我们对其在脊髓损伤后如何作出反应并组织瘢痕性伤口愈合中的具体作用却知之甚少。此外,反应性星形胶质细胞在轴突再生过程中失败的机制也不清楚。


为了解决这些问题,来自美国哈佛医学院、加州大学洛杉矶分校以及俄亥俄州立大学等三所高校神经科学系的Yi Li等诸位学者,试图确定脊髓再生是否可以发生在新生小鼠中。毕竟在新生小鼠所处的这一发育阶段,中枢神经系统的神经元仍存在强大的生长能力。该研究发现新生小鼠脊髓挤压伤后可出现无瘢痕愈合,从而允许长轴突投射于病灶内并且正常生长。而新生小鼠中小胶质细胞的缺失,破坏了这一愈合过程,并阻碍了轴突的再生,这表明小胶质细胞在协调损伤反应方面的作用是至关重要的。利用scRNA-seq和相关的功能分析,发现新生儿小胶质细胞是短暂激活的,并且在无瘢痕愈合中至少起到两个关键作用。首先,它们暂时分泌纤维连接蛋白及其结合蛋白,形成细胞外基质桥,将切断的脊髓末端连接起来;其次,新生的而非成熟的小胶质细胞表达多种细胞外和细胞内肽酶抑制剂,以及其他的抗炎因子。


将新生的小胶质细胞或经过肽酶抑制剂处理的成熟小胶质细胞移植到成年小鼠脊髓损伤部位中,发现两种类型的小胶质细胞都能显著促进神经损伤的愈合和轴突再生。


总之,该研究结果揭示了新生小鼠脊髓损伤后几乎可以达到完全修复的细胞与分子学基础,并提出了可能用于促进成熟哺乳动物中枢神经系统损伤后无瘢痕愈合的修复策略。


脊髓损伤后小胶质细胞和巨噬细胞通过Plexin-B2促进细胞聚集、创面填充和损伤修复



中枢神经系统损伤后,神经胶质细胞被动员形成保护屏障,以封闭伤口、尽可能减小组织损伤的程度。这一屏障还有助于清除组织坏死碎片,减轻炎症反应,促进伤口压实以及细胞基质重组,从而减少瘢痕形成,最大程度修复损伤。Burda等[4]在2014年发表的研究中提出了更好的解释,即建立这样的屏障涉及到一个被称为“聚合作用”的过程,即吞噬细胞被限制在病变核心,病变核心被反应性星形胶质细胞的狭窄边缘包围,这些边缘将坏死核心与周围的健康组织分隔开。Courtine等人[5]在2019年对这一概念进行了补充 ,认为“聚合作用”的过程是减轻由炎症细胞因子、蛋白酶和损伤核团内部释放的自由基所引发的继发性组织损伤的重要步骤。


2005年,Davalos等[6]曾提出中枢神经系统损伤会在几分钟内触发小胶质细胞的激活,随后是受趋化因子吸引的血源性免疫细胞的涌入,并因血脑屏障的破坏而加剧这一过程。血源性单核细胞分化为吞噬细胞,与小胶质细胞一起构成固有免疫,负责清除组织细胞碎片,提供营养因子和抗炎因子的来源,促进组织修复;然而,它们同时也会释放炎症细胞因子来加剧继发性损伤。因此,固有免疫反应可以同时缓解和/或加剧组织损伤。目前为止,我们已经对小胶质细胞和巨噬细胞(IAMs)的吞噬和抗炎功能有了更好的了解;然而,它们是否有助于“聚合作用”的过程以及促进伤口基质的填充及其潜在的信号机制尚不清楚。


根据美国纽约州西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所神经外科的Xiang Zhou 与Shalaka Wahane等人的最新研究,证明了在损伤刺激下IAMs中存在的一种参与激活轴突引导通路的暂时性独特基因特征。该研究证明,Plexin-B2在IAMs中上调,是脊髓损伤后运动感觉恢复所必需的。髓系细胞中Plexin-B2的缺失会破坏细胞的聚集,导致弥漫性组织损伤、炎症扩散并阻碍轴突再生。从机制上讲,Plexin-B2促进小胶质细胞运动,引导IAMs远离碰撞细胞,促进基质填充来调节“聚合作用”的过程。其研究成果于2020年3月正式发表在Nature Neuroscience杂志,向全世界范围的神经科学领域展示了Plexin-B2是伤口愈合过程中整合IAMs与损伤微环境的生化线索和物理相互作用的重要环节。


恢复细胞能量能促进脊髓损伤后的轴突再生和功能修复




成熟的中枢神经系统神经元在损伤后通常无法再生,将导致永久性的神经损伤。先前的研究已经阐述了影响轴突再生的遗传过程、信号机制和细胞外抑制因子。这些研究表明,成熟的中枢神经系统再生能力受限主要由于内在条件的限制。


Anderson等[7]于2018年在Nature上杂志发表的研究中曾表示,虽然刺激内在生长潜能可以促进轴突再生,但脊髓损伤(SCI)模型轴突再生失败的潜在机制很大程度上仍然未知。


这就自然联想到轴突成功再生的基本条件,包括受损后必须重新密封其受损的终端,重建细胞骨架,合成与运输重建材料,组装轴突组件,并形成生长锥。所有这些都需要线粒体ATP供能。由于结构极化与轴突延伸,神经元维持远端轴突和生长锥内线粒体分布和能量稳态面临特殊的挑战。因此,激活受损轴突的线粒体运输对于促进其再生至关重要。之前Lewis等[8]已经揭示Syntaphilin (Snph)作为一种静态锚定蛋白,通过微管相互作用使轴突线粒体固定。Zhou等[9]也证实在成熟的神经元中,Snph表达显著增加,从而使成熟中枢神经系统中的大多数轴突线粒体保持稳定。因此,局部能量供应的恢复可能对支持损伤的长投射轴突再生至关重要。


通过关闭Snph介导的锚点来增强轴突线粒体运输,是否有助于清除受损的线粒体?是否有助于补充受损轴突中的健康线粒体,从而满足再生过程中增加的能量需求呢?为解答这个疑惑,美国斯塔克神经科学研究所脊髓和脑损伤研究小组的 Han等学者通过在SCI模型体内实验中验证了这一假说,并从概念上推进了我们对于局部能量学对轴突再生、突触重新连接和运动功能恢复影响的认识。


中枢神经系统的轴突再生是一个高能量消耗的过程,外在的损伤和内在的限制会导致受损轴突中出现能量危机,如果是这样的话,补充足够能量是否会促进轴突的再生?研究发现,通过敲除Syntaphilin(Snph)来增强轴突线粒体的运输,可以恢复损伤诱导的线粒体去极化。利用三种中枢神经系统损伤小鼠模型,证明了Snph敲除后的小鼠,在SCI后显示出明显的皮质脊髓束再生,并且穿过损伤区域的单胺能轴突再生加速,未损伤的皮质脊髓束出现代偿。值得注意的是,再生的皮质脊髓束轴突形成功能性突触并促进运动功能恢复。使用生物能量化合物肌酸可以提高Snph敲除后的小鼠皮质脊髓束的再生能力。


本研究还提供了中枢神经系统轴突再生失败的内在机制,并提示增强线粒体运输和细胞能量学供应是促进中枢神经系统损伤后再生与功能恢复的前提。作者提出的“损伤引起的能量危机”假说得到了肌酸系统管理的进一步支持,肌酸是能量的促进剂。最终证实,损伤引起的能量危机会导致SCI后的中枢神经系统再生失败。SCI后,通过增强线粒体运输或增加能量代谢来恢复局部能量,都能促进轴突的萌发和再生。总体而言,为中枢神经系统损伤后刺激脊髓再生和功能恢复提供了一个很有前景的细胞水平的新研究。


脊髓损伤后神经干细胞移植可形成与宿主广泛的突触连接



很多研究进展纷纷表示,诱导损伤后成人中枢神经系统再生是非常困难的。但根据Fischer等人[10]最新的报告表明,神经祖细胞或神经干细胞植入脊髓损伤(SCI)部位可支持广泛的宿主轴突再生到病变部位的移植物中,而移植神经元的轴突可以大量(数万至数十万)延伸至远端宿主脊髓(最远可达50毫米);Etlin等人[11]提出移植物神经元可以调节宿主神经元的活性,并且证明在病变部位,从宿主移植物到宿主同样可以形成新的突触传递。然而,对于脊髓损伤部位的宿主神经祖细胞与神经干细胞(NSPC)移植物产生突触结构的详细过程,我们却知之甚少。


在神经元群体水平上,宿主轴突再生到移植物上是如何影响移植物神经元活性的?这一点尚未被描述,存在几种可能性:首先,再生的宿主轴突可能形成单个宿主轴突与单个移植神经元的配对,代表高度局限的投射,涉及相对较少的移植神经元。第二,再生的宿主轴突可能招募更大的移植物神经元网络,这与之前描述的完整脊髓中皮质脊髓投射的目标相似。第三种可能性是,密集的轴突再生区域作为起始,激活邻近的神经元群体,引起兴奋性在移植物中缓慢扩散,类似癫痫、中风和其他神经疾病的发病机理。在后一种情况下,人们可以预测,宿主运动轴突再生到移植物时,其激活的一系列刺激会在移植物中引起兴奋波,这种兴奋波会在病变部位缓慢传播。考虑到NSPC移植物在改善两种啮齿类动物脊髓损伤后的功能预后方面的益处,更多的关注点也集中于了解哪些机制可能在发挥作用。


加州大学圣地亚哥分校神经科学系的Ceto等研究人员发现,宿主输入到脊髓损伤部位的干细胞移植物可以激活不同的移植物神经元群。并于2020年在Cell Stem Cell杂志率先发表其研究成果:移植物神经元可以被机体的感觉输入不断激活,并能激活损伤部位以下的宿主神经元,支持通过损伤部位恢复其突触连接的能力。


该研究将NSPC移植物整合到SCI的部位,验证了损伤部位能够产生神经元传递,从而促进神经功能的改善。为了确定移植物是否可以形成突触,以及如何形成突触并与宿主系统连接,选择在体内脊髓损伤部位和成人脊髓切片中,对NSPC移植物使用钙成像分析。通过分析发现,NSPC移植物组织呈现局部自发活跃的突触网络。并且宿主皮质脊髓束轴突再生到移植物中的光遗传学刺激,在整个移植物中可以引起不同的神经元网络反应。此外,从移植物延伸到去神经脊髓的衍生轴突的光遗传学刺激也触发了局部宿主神经元网络反应。活体成像显示,行为刺激同样引起移植物内的局灶性突触反应。以上发现均更新了以往的观点,认为NSPC移植物可形成功能性突触亚网络,其活动模式类似于完整的脊髓。


该研究的创新点包括:

1.借助钙显像显示了宿主到干细胞的移植物突触连接;

2.提出宿主输入到移植物的刺激可以激活移植物内的神经元网络;

3.移植物又可以进一步激活病变部位以下的宿主神经元;

4.宿主的行为刺激引发移植物中的神经元反应。


急性脊髓损伤后手术减压越早越好



急性外伤性脊髓损伤(SCI)给患者、家庭及社会带来巨大的压力和负担。SCI的临床表现包括瘫痪、麻木、排尿或排便功能丧失。尽管对潜在的神经保护和再生疗法进行了相关研究,但SCI患者的治疗选择仍然很少,目前仅仅依靠目标血压管理,激素使用和及时有效的脊髓减压术来缓解病情进展。尽管早期对损伤脊髓行减压术有着很强的生物学基础[12],但具体到临床实践中,实际情况却存在较大的差异性,因此手术减压时机对SCI的影响仍存在争议。各种不同的时间阈值也被用来定义损伤后的早期手术时间窗,其中,以损伤后24h作为时间点所展开的研究使用最为频繁。然而,SCI 在24小时内行手术减压的作用本就存有一定争议,并无明确的证据证明其有益。因此,对于成人急性SCI患者,行减压手术时机对预后有何影响,需要更高质量的研究证据,以便指导临床指南和临床实践。


为了更加客观地评价急性脊髓损伤后手术减压时机对患者神经功能预后的长期影响。由来自多伦多大学、托马斯·杰斐逊大学、马里兰大学医院神经外科与骨外科的Jetan H Badhiwala等临床学者对来自4个独立、前瞻性、多中心数据源的患者个体化信息进行汇总分析,时间跨度为1991年12月至2017年3月。所有急性SCI患者都接受了减压手术,分为早期减压组(脊髓损伤后<24 h)和晚期减压组(脊髓损伤后≥24 h)。通过美国脊髓损伤协会(ASIA)或国际脊髓损伤神经分类标准(ISNCSCI)评估神经功能预后。主要分析点为从基线到脊髓损伤1年后总运动得分的变化。次要分析点为1年后 AIS分级和上肢运动、下肢运动、轻触和针刺评分的变化。整合基线评分、年龄、损伤机制、AIS分级、损伤水平和甲强龙使用情况等因素,通过分层混合效应回归分析法进行单步骤荟萃分析。效应量由感觉运动评分的平均差(MD)和AIS评分的共同优势比(cOR)进行总结,对应的CI为95%。作为二次分析,总的运动得分的变化与手术减压时间(h)作为一个连续变量进行回归,使用限制性立方条带与原始分析中相同的协变量进行调整。


2020年,该团队将其分析成果发表在Lancet Neurology杂志,从四个数据集中确定的1548名符合条件的患者进行了总结分析。在脊柱损伤的1年后,早期接受手术减压的患者(n=528)比晚期接受手术减压的患者(n=1020)有更好的恢复效果。早期手术组的总运动功能恢复评分、轻触功能评分、针刺评分比晚期手术组均有明显提高。与晚期手术的患者相比,早期行减压手术的患者在术后1年的AIS评分也更好。


从该研究获得的结果中不难分析出,当手术减压时间被建模为一个连续变量时,在损伤后的前24 ~ 36h内,随着时间的增加,总运动得分的变化急剧下降(p<0.0001);36 h后,总运动得分的变化趋于平稳。因此,急性脊髓损伤后24h内的手术减压与感觉运动恢复改善情况呈息息相关。SCI后的前24 ~ 36h似乎是急性脊髓损伤后通过减压手术实现最佳神经功能恢复的关键时间窗。


【参考文献】

[1] Miller Freda D, Kaplan David R, Mobilizing endogenous stem cells for repair and regeneration: are we there yet?[J] .Cell Stem Cell, 2012, 10: 650-652.

[2] Mokalled Mayssa H, Patra Chinmoy, Dickson Amy L et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish.[J] .Science, 2016, 354: 630-634.

[3] Zukor Katherine A, Kent David T, Odelberg Shannon J, Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts.[J] .Neural Dev, 2011, 6.

[4] Burda Joshua E, Sofroniew Michael V, Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease.[J] .Neuron, 2014, 81: 229-48.

[5] Courtine Grégoire, Sofroniew Michael V, Spinal cord repair: advances in biology and technology.[J] .Nat Med, 2019, 25: 898-908.

[6] Davalos Dimitrios, Grutzendler Jaime, Yang Guang et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.[J] .Nat Neurosci, 2005, 8: 752-8.

[7] Anderson Mark A, O'Shea Timothy M, Burda Joshua E et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury.[J] .Nature, 2018, 561: 396-400.

[8] Lewis Tommy L, Turi Gergely F, Kwon Seok-Kyu et al. Progressive Decrease of Mitochondrial Motility during Maturation of Cortical Axons In Vitro and In Vivo.[J] .Curr Biol, 2016, 26: 2602-2608.

[9] Zhou Bing, Yu Panpan, Lin Mei-Yao et al. Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits.[J] .J Cell Biol, 2016, 214: 103-19.

[10] Fischer Itzhak, Dulin Jennifer N, Lane Michael A, Transplanting neural progenitor cells to restore connectivity after spinal cord injury.[J] .Nat Rev Neurosci, 2020, 21: 366-383.

[11] Etlin Alex, Bráz Joao M, Kuhn Julia A et al. Functional Synaptic Integration of Forebrain GABAergic Precursors into the Adult Spinal Cord.[J] .J Neurosci, 2016, 36: 11634-11645.

[12] Batchelor Peter E, Wills Taryn E, Skeers Peta et al. Meta-analysis of span-clinical studies of early decomspanssion in acute spinal cord injury: a battle of time and spanssure.[J] .PLoS One, 2013, 8: e72659.



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