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NEO100能够向大脑传递血脑屏障不可渗透的治疗药物

2020-11-04 高谋 邱天明

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血脑屏障维持中枢神经系统的稳定,但阻碍抗肿瘤药物进入CNS,不利于发挥药效。

美国南加利福尼亚州大学神经外科的Weijun Wang等研发经动脉注射一种天然的高度纯化单萜类物质紫苏醇,可以安全、有效、可控、快速和可逆打开BBB,而且无不良反应。结果发表于2020年9月的《Neuro-Oncology》在线。


——摘自文章章节

【Ref: Wang W, et al. Neuro Oncol. 2020 Sep 2;noaa206. doi: 10.1093/neuonc/noaa206. [Epub ahead of print]】


研究背景



血脑屏障(BBB)维持中枢神经系统(CNS)的稳定,但阻碍抗肿瘤药物进入CNS,不利于发挥药效。数十年来,经颈动脉注射甘露醇能够向大脑传递不可渗透BBB的药物。但是,该方法操作复杂而且风险较高,可引发癫痫、脑动脉栓塞、脑出血和脑水肿,限制其推广应用。因此,亟待寻求一种安全、快速的方法开放BBB。美国南加利福尼亚州大学神经外科的Weijun Wang等研发经动脉(IA)注射一种天然的高度纯化单萜类物质紫苏醇(NEO100),可以安全、有效、可控、快速和可逆打开BBB,而且无不良反应。结果发表于2020年9月的《Neuro-Oncology》在线。


研究方法



研究者在体外通过跨上皮或内皮细胞电阻(TEER)和抗体弥散试验评估NEO100对细胞屏障通透性的影响。采用蛋白质印迹、微阵列分析和电子显微镜进行相关机制的研究。在小鼠模型中超声引导下向心脏内给于NEO100,然后静脉注射伊文氏蓝(Evan's blue)、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)、检查点阻断抗体或嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T),测定透过BBB的状况。


研究结果



研究结果显示,NEO100增加细胞屏障通透性。采用2mM NEO100处理MDCK1细胞转运屏障模型,可显著改变细胞屏障的完整性;1mM NEO100处理脑内皮细胞(EC)+星形胶质细胞,细胞屏障遭破坏(图1A)。使用TEER检测发现NEO100给药10min后,细胞屏障破坏明显,并在给药3h内保持开放状态(图1B),而在撤药18h后细胞屏障完全恢复(图1C)。用1mM NEO100处理0.5h后,脑内皮细胞膜通透性发生改变,作用持续6h,给药4h后细胞膜通透性达最大程度(图1D)。可见NEO100增加细胞质中紧密连接蛋白和辅助蛋白的水平,而降低细胞膜的水平(图1E)。


图1. NEO100增加细胞屏障通透性。A.测定不同浓度NEO100处理4h后MDCK1和来源于患者的脑内皮细胞(EC)+星形胶质细胞屏障的通透性。B.TEER检测用2mM NEO100处理MDCK1(左图)或1mM NEO100处理EC+星形胶质细胞(右图)后,细胞屏障通透性随时间的变化状况。C.用2mM NEO100处理MDCK1(左图)或1mM NEO100处理EC+星形胶质细胞(右图)3h后停用NEO100,并用TEER检测细胞屏障通透性恢复情况。D.柱状图显示HPLC测定EC上清液中残留的NEO100及其稳定的代谢产物浓度。E.Western blot检测显示细胞膜与细胞质中紧密连接蛋白(TJ)、辅助蛋白claudin-3、claudin-5、JAM、ZO-1和occludin水平。


IA注射NEO100开放BBB呈剂量依赖性,如NEO100注射剂量与脑组织中伊文氏蓝(EB,961 Da)浓度呈正相关(图2A-C)。而用甘露醇代替NEO100则不会出现EB外渗(图2A)。此外,IA注射NEO100可立即开放BBB,持续2-4h(图2D),说明IA注射NEO100能够迅速可逆地开放BBB。BBB恢复正常后,脑组织中外渗的EB最多残留7d(图2E)。透射电镜发现,脑血管腔周围紧密连接的超微结构发生改变,例如IA注射0.3% NEO100后,小鼠内皮细胞之间出现裂隙(图2F),说明IA注射NEO100可破坏细胞间连接介导BBB的开放。


图2. IA注射NEO100能够即刻、短暂、可逆地打开BBB。A.上、中和下三图各为IA注射NEO100、经静脉(IV)注射NEO100和IA注射甘露醇时的小鼠脑组织内EB含量。B.从前图到后图示,IA注射3%、0.3%、0.03%和0% NEO100时小鼠脑组织冠状位切片。C.检测脑室周围EB自发荧光。D.IA注射3% NEO100后,在指定时间点通过尾静脉注射2% EB,并在2h后,处死动物留取脑组织。E.从A图至H图各为正常小鼠、IA注射3% NEO100+IV注射2% EB后30min、120min、240min、1d、3d、5d和7d的小鼠脑组织图片。F.透射电镜显示,BBB超微结构发生改变,正常脑组织(左图)内皮细胞(EC)之间为紧密连接线,而IA注射NEO100后EC之间出现裂隙(右图)。


IA注射NEO100能够向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物甲氨蝶呤。研究者分别用IA注射NEO100、经静脉(IV)注射甲氨蝶呤或IA注射NEO100+IV注射甲氨蝶呤处理实验动物2h后,发现IA注射NEO100+IV注射甲氨蝶呤动物组的脑组织和脑脊液(CSF)中,甲氨蝶呤的含量明显高于其它处理组(图3)。

图3. IA注射NEO100能够向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物甲氨蝶呤。A.双光子显微镜检测甲氨蝶呤自发荧光,IA注射0.3% NEO100+IV注射MTX时,小鼠脑组织中可检测到甲氨蝶呤(白色)。B.HPLC测定血清、脑和CSF中甲氨蝶呤水平。
 
NEO100介导BBB开放促进抗PD-1抗体进入大脑。相比未处理或IV注射抗PD-1抗体,IA注射0.3% NEO100能够显著增加脑肿瘤区抗PD-1抗体的浓度;而在正常脑组织中未能检测到PD-1抗体,表现出对脑肿瘤组织有较高的特异性和亲和力。此外,相比未处理或IV注射抗PD-1抗体,IA注射0.3% NEO100能够显著增加脑肿瘤区CD8+T细胞的数量,说明IA注射NEO100不仅能够增加脑肿瘤中抗PD-1抗体的浓度,还可通过抗PD-1抗体重建肿瘤微环境中的免疫功能。
 
IA注射NEO100增加脑肿瘤区CAR-T细胞数量。研究者建立原发性CNS异种淋巴瘤颅内移植小鼠模型,分别用IV注射CAR-T细胞(5×106)或用IA注射0.3% NEO100+IV注射CAR-T细胞(5×106)处理。相比未处理和IV注射CAR-T细胞,IA注射0.3% NEO100显著增加脑肿瘤区CD3+CAR-T细胞数量,并且CD3+CAR-T细胞优先集中在脑肿瘤区,在正常脑组织中未检测到CD3+CAR-T细胞,表现出对脑肿瘤组织较高的特异性和亲和力(图4)。


图4. IA注射NEO100增加脑肿瘤内CAR-T细胞浸润数量。A.相比未处理或IV注射人CAR-T细胞,IA注射NEO100显著增加脑肿瘤区CD3+CAR-T细胞的数量。B.图示BBB的结构,包括EC、周细胞和星形胶质细胞足突,以及免疫球蛋白、白细胞(中性粒细胞,直径10-12μm;淋巴细胞,直径6-14μm)和红细胞(直径7.5μm)。


结论



该研究结果表明,IA注射NEO100能够安全、迅速、高效和可逆地打开BBB,促进甲氨蝶呤、抗PD-1抗体和CAR-T细胞进入CNS。因而,IA注射NEO100有望成为一种安全,应用广泛,向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物的方法。


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